本发明涉及棘孢肽类化合物及其制备方法；本发明还涉及该化合物在抗肿瘤剂中的用途。所述化合物通过发酵培养棘孢木霉(Trichodermaasperellum)，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化出该化合物。本发明的棘孢肽类化合物属于活性线性小肽，并且是罕见的C端与N端同时乙酰化。所述棘孢肽类化合物具有抗肿瘤活性。可作为制备细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂用于抗肿瘤的研究。化合物ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="504"/>的制备方法，其特征在于：通过发酵培养棘孢木霉(Trichodermaxa0asperellum)，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化得到该化合物；其中所述棘孢木霉(Trichodermaxa0asperellum)为棘孢木霉(Trichodermaxa0asperellum)xa0IBPT-2已于2012年10月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号是：CCTCCxa0Mxa02012438。技术领域
本发明涉及棘孢肽类化合物及其制备方法；本发明还涉及该化合物在抗肿瘤剂中的用途。
背景技术
棘孢肽类化合物（peptaibol）主要是来源于木霉属的一类活性线性小肽，常被报道具有抗菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫等活性，并且C端与N端同时乙酰化的棘孢肽十分罕见。本发明人研究得知，棘孢木霉(Trichodermaxa0asperellum)xa0(2012年10月31日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号是：CCTCCxa0Mxa02012438)液体发酵产物的粗提物有很好的细胞增殖抑制活性，遂对其活性成分进行研究。研究发现棘孢肽类化合物具有抗肿瘤活性，目前尚未见该化合物的化学结构及细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种棘孢肽类化合物及其制备方法和用途，该化合物具有抑制肿瘤细胞增殖作用，具有抗肿瘤活性。其结构式为：ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="552"/>xa0xa0xa0xa0其结构特征是：含有六个甲基丙氨酸残基、一个缬氨酸残基、一个异亮氨酸残基、一个丝氨酸残基，并且C端与N端同时乙酰化。本发明还提供了所述化合物的制备方法：发酵培养棘孢木霉(Trichodermaxa0asperellum)，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化出该化合物。xa0所述棘孢木霉(Trichodermaxa0asperellum)xa0为棘孢木霉(Trichodermaxa0asperellum)xa0IBPT-2，已于2012年10月31日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址:xa0武汉xa0武汉大学，保藏编号是：CCTCCxa0Mxa02012438。本发明还保护了所述的化合物在制备细胞增殖抑制剂中的用途。及该化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明的显著优点：研究所示棘孢肽类化合物属于活性线性小肽，并且是罕见的C端与N端同时乙酰化。所述棘孢肽类化合物具有抗肿瘤活性，目前尚未见该化合物的化学结构及细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
具体实施方式
在如下的实施例中所指的化合物的化学结构：ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="503"/>实施例1该化合物的发酵生产及分离精制1发酵生产生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取棘孢木霉(Trichodermaxa0asperellum)xa0IBPT-2xa0(2012年10月31日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号是：CCTCCxa0Mxa02012438)xa0适量，接种到PDA固体斜面培养基上在28摄氏度培养箱中培养4天。取斜面培养4天的棘孢木霉(Trichodermaxa0asperellum)xa0适量，接种到装有400mL培养液xa0[xa0培养基组成(克/升)：甘露醇20.0，酵母膏3.0，麦芽糖20.0，味精10.0，葡萄糖10.0，KH₂PO₄xa00.5xa0，MgSO₄xa00.3，海水xa0]xa0的1000mL锥形瓶中，28℃静止培养30天后，获得菌丝体和发酵液。2xa0浸膏的获得xa0用纱布将菌丝体和发酵液分离。将发酵液与乙酸乙酯1:2萃取两次，萃取液减压蒸馏至干，得到发酵液的乙酸乙酯浸膏。3xa0化合物的分离精制xa0浸膏用100-200目硅胶拌样后，以石油醚：二氯甲烷：甲醇梯度组分为洗脱液，通过300-400目硅胶进行减压硅胶色谱柱层析，得到5个组分（A-E）。收集组分Bxa0(二氯甲烷-甲醇20:1洗脱物)，以石油醚：二氯甲烷：甲醇梯度组分为洗脱液，通过加压硅胶柱层析，得4个组分（B1-B4）。收集组分B3（二氯甲烷-甲醇为20:1的洗脱物）通过氯仿-甲醇(1:2)为溶剂进行Sephadexxa0LH-20凝胶柱层析，再经过RP-18反相硅胶柱层析以甲醇-水(3:2)为溶剂洗脱，最后通过半制备液相色谱(1010型ODS-A，10×250xa0mm，5μm)：分离流速为5xa0mL/min，流动相为50%乙腈水溶液，得到所示化合物。化合物xa0xa0xa0无色晶体，正离子HR-ESI-MSxa0m/z:xa0995.6172xa0[Mxa0+xa0H]^xa0+，分子式C₄₇H₈₂N₁₀O_13；xa0[α]²⁵_Dxa0-22xa0(c=0.1,xa0MeOH);xa0¹H和¹³C-NMR等NMR数据见表1。负离子二级质谱碎片离子xa0(-)ESIMS/MSxa0m/zxa0994,xa0964,xa0922,xa0837,xa0751,xa0652,xa0567；正离子二级质谱碎片离子(+)xa0ESIMS/MSxa0m/zxa01018xa0[Mxa0+xa0Na]+,xa0847,xa0762,xa0674,xa0589,xa0504,xa0391,xa0306。表1化合物的¹H和¹³C-NMR数据(500和125MHz，inxa0DMSO-d₆)^antent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="553"/>ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="553"/>ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="553"/>a)xa0本表信号归属基于DEPT、HMQC及HMQC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定。b)xa0xa0此栏中的数字和代号分别代表在¹H-¹Hxa0COSY谱中与相应行中的¹H给出耦合相关信号的¹H核。c)xa0xa0此栏中的数字和代号分别代表在HMBC谱中与相应行中的¹H给出耦合相关信号的¹³C核。d)xa0xa0此栏中的A=Aib,xa0V=Val,xa0I=Ile,xa0S=Ser。实施例2xa0体外抗肿瘤活性的测试1xa0实验样品及实验方法被测样品溶液的配制xa0xa0测试样品为上述实施1中分离精制的化合物纯品。精密称取适量样品，用甲醇配制成所需浓度的溶液，供测活性。细胞系及细胞的继代培养采用人肺癌A549细胞系。细胞用含10%FBS的RPMI-1640培养基，在37℃于通入5%二氧化碳的培养箱中继代培养。细胞增殖抑制活性测试方法xa0丽丝胺罗丹明B（SRB）法xa0xa0取对数生长期的人肺癌A549细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2×10⁵个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于96孔细胞培养板中，每孔加入2微升不同浓度的样品或空白溶液，于37℃下培养24小时。取在药物作用下培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，判断有无细胞周期抑制，细胞坏死的形态学特征，继而在4℃、3000转/分钟离心3分钟，吸去上清液。每孔细胞中加入20%三氯醋酸50微升，置于4℃固定1小时，用水冲洗5次并空气干燥。每孔加入0.4%xa0SRB的醋酸溶液50微升并在室温静置30分钟。用1%醋酸水清洗4次，除去未结合的游离SRB染料。每孔加入150微升Tris换成（100mmol/L，pHxa010.5）溶解蛋白结合染料并利用酶标仪测定每孔在520nm处的光密度（OD）值。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，另设三孔空白对照和无细胞调零孔（如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞调零）。各孔OD值先做相应无细胞调零，再取三孔平均OD值按IRxa0(%)xa0=xa0(OD空白对照-OD样品)/OD空白对照xa0×xa0100%式计算每个浓度下的样品对细胞增殖抑制率xa0(IR%)。根据不同浓度的抑制率计算，得出IC₅₀值。2.xa0实验结果细胞增殖抑制活性测试结果在SRB法测试中，该化合物对人肺癌A549细胞的增殖抑制结果：IC₅₀=0.48mg/mL。3.xa0结论化合物具有明显的肿瘤细胞增殖抑制作用，可作为制备细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂用于抗肿瘤的研究。